Экстракт растительных стволовых клеток для долголетия кожи и волос

Стволовые клетки

  1. Schmid, C. Schürch, P. Blum, E. Belser, F. Zülli

Экстракт растительных стволовых клеток для долголетия кожи и волос

Ключевые слова: стволовые клетки, культивирование растительных клеток, старение, волосяные фолликулы.

Что такое стволовые клетки?

Стволовые клетки – это незапрограммированные клетки, которые могут дифференцироваться в клетки со специальными функциями. Следовательно, стволовые клетки обладают большим потенциалом в регенеративной медицине. Регенеративные (восстановительные) виды терапии используются для стимуляции заживления и в будущем могут быть применены для лечения болезней Паркинсона, Альцгеймера или диабета.

Регенеративная медицина приведет к увеличению продолжительности здоровой жизни. Сейчас исследования стволовых клеток – интересная, трендовая тема, которая уже нашла свое применение в косметике. Amatokin – главный продукт линии по уходу за кожей лица от компании Voss Laboratories – заявлен как стимулирующий стволовые клетки в коже. Dior’s CaptureR60/80 XP – продукты против морщин; принцип действия товаров серии основан на защите жизненной силы стволовых клеток.

Так что же такое стволовые клетки в более конкретном смысле? Главные принципы, которые определяют популяции стволовых клеток, включают: 1) способность восстанавливать самих себя через самообновление; 2) способность генерировать дифференцированные клетки.

Существует два типа стволовых клеток у людей и животных: эмбриональные стволовые клетки и взрослые стволовые клетки. Эмбриональные стволовые клетки плюрипотентны, и поэтому они могут дифференцироваться во все типы клеток тела. Роль взрослых стволовых клеток заключается в сохранении и восстановлении тканей. Они более ограниченны и, как правило, способны дифференцироваться только в те различные типы клеток ткани, в которых они обнаружены. Но также существуют взрослые стволовые клетки с плюрипотентным потенциалом (с возможностью дифференцировки). Они – основной объект новейших исследований, потому что взрослые стволовые клетки и работа с ними не имеет этических причин для озабоченности.

Каждая клетка, будь то стволовая или дифференцированная, имеет один и тот же ДНК, а значит – одни и те же гены. Так что делает клетку стволовой? Их характеристики зависят от сигналов из микроокружения, то есть из соседних клеток, которые образуют своего рода сектор. Но прежде всего существуют сигналы внутри самих клеток, которые контролируют их участь. Эти сигналы называются эпигенетическими сигналами. Если вкратце, это некие «метки» на ДНК или окружающих гестоновых белках, которые регулируют «включение» и «выключение» генов.

Резюме

Стволовые клетки старого сорта яблок с очень хорошими свойствами длительного хранения были созданы с помощью применения техники культивирования растительных клеток. Экстракт культивированных яблочных стволовых клеток продемонстрировал повышение жизнеспособности стволовых клеток пуповинной крови, обращение вспять признаков старения в человеческих фибробластах и увеличение срока жизни изолированных волосяных фолликулов человека. PhytoCellTech™ Malus Domestica (косметический ингредиент, основанный на инкапсулированном экстракте культивированных яблочных стволовых клеток) был протестирован в ходе клинического испытания на протяжении более 4 недель с участием 20 субъектов. Было обнаружено, что этот новый ингредиент способен значительно уменьшить морщины типа «гусиные лапки» в области вокруг глаз.

Надписи слева (сверху вниз):

Эпидермальный слой

Базальный слой

Наружное корневое влагалище

Внутреннее корневое влагалище

Стержень волоса

Матрица волосяного фолликула

Надписи справа (сверху вниз):

Сальная железа

Стволовые клетки утолщенного волосяного фолликула

Дермальный гребень

Надпись под картинкой:

Рисунок 1. Утолщение волосяного фолликула содержит мультипотентные стволовые клетки, которые вносят свой вклад в клеточные линии эпидермиса, сальную железу и волосяной фолликул.

Роль стволовых клеток в коже

Кожа – самый большой орган человеческого тела. Она покрыта эпидермисом – многослойным эпителием. Эпидермис включает интерфолликулярный эпидермис, волосяные фолликулы и сальные железы. Поскольку окончательно дифференцированные клетки эпидермиса отшелушиваются (с кожи), должно быть беспрерывное поступление вновь дифференцирующих клеток. Это показывает важность стволовых клеток в коже. Существуют убедительные доказательства того, что в утолщении волосяного фолликула формируется хранилище эпидермальных стволовых клеток (рис. 1). Оттуда стволовые клетки периодически мигрируют в матрицу волосяного фолликула, сальную железу и базальный слой интерфолликулярного эпидермиса (показано пунктирными розовыми линиями) для создания клеток-предшественниц, которые дифференцируются в клетки волоса, клетки желез или клетки верхних эпидермальных слоев соответственно (показано зелеными пунктирными линиями).

Базальный слой эпидермиса содержит два различных типа популяции клеток (рис. 2): (1) медленно делящиеся стволовые клетки и (2) их потомство, которое быстро делит клетки для поддержки новых клеток и замены тех, которые были утрачены вследствие отшелушивания. После ограниченного числа делений они отделяются от базальной мембраны и начинают программу дифференциации, которая в конечном итоге приводит к образованию клеток рогового слоя. Новейшие исследования показали, что стволовые клетки могут составлять от 2 до 7% от общего числа клеток базального слоя.

Тот факт, что самообновление эпидермальных стволовых клеток проходит медленно, важен, потому что они умирают после определенного числа делений и каждое деление несет риск летальных мутаций ДНК. Потеря стволовых клеток – намного более разрушительный для ткани процесс, нежели потеря дифференцированных клеток. Появление седины на волосах, например, может быть результатом того, что меланоцитные стволовые клетки в волосяном фолликуле умерли.

У растений тоже есть стволовые клетки. Две популяции стволовых клеток (одна, включающая апикальную меристему побега, и другая, с апикальной меристемой корня) обеспечивают рост растительного организма. Сохранение стволовых клеток растений также зависит от сигналов из микроокружения и от схожего эпигенетического контроля (как в стволовых клетках млекопитающих). В отличие от людей, взрослые растения содержат тотипотентные стволовые клетки с потенциалом для регенерации всего растения. Технология культивирования ткани растения основана на размножении растительных стволовых клеток для создания целого растения, одной лишь ткани или только отдельных клеток в культуре для сбора растительных метаболитов.

Данная методика позволяет создавать растительный материал в стерильных и стандартизированных условиях независимо от сезона и других ограничений окружающей среды. Культуры клеточных тканей растения могут быть произведены почти из всех тканей растения. Тканевый материал, получаемый из растений для культивирования, называется эксплантат. Как и при заживлении ран, новые клетки формируются на поверхностях разреза эксплантата.

Клетки медленно делятся для формирования бесцветной клеточной массы, которая называет каллюс. Эти клетки дедифференцировались в клетки, которые имеют недостаток характерных свойств нормальных растительных клеток. Клетки каллюс – стволовые клетки, сопоставимые с аналогичными клетками меристемных тканей. Для высокопродуктивного производства клетки каллюса могут быть культивированы как индивидуальные клетки или маленькие клеточные кластеры в жидкостной культуре.

Яблочные стволовые клетки сортов

c отличными показателями хранения

Свежее яблоко – символ красивой кожи. Яблоки с очень хорошими свойствами длительного хранения остаются свежими многие месяцы. Эти яблоки должны иметь особенные, долгоживущие стволовые клетки ткани. Можем ли мы извлечь выгоду из этих стволовых клеток? Каким будет эффект (на коже) экстракта на основе настолько долгоживущих стволовых клеток? Но коммерчески доступные яблоки не пригодны для длительного хранения. Они отобраны для интенсивного культивирования и приятного сладкого вкуса. Когда-то показатели хранения были важным фактором при селекционном отборе.

Некоторые из этих старых сортов выжили в качестве изолированных деревьев на территориях с менее интенсивным земледелием. Uttwiler Spätlauber – это яблочное дерево, которые было культивировано в первую очередь из-за его хороших свойств хранения (рис. 3). Сорт Spätlauber получается из рассады, которая была посажена в середине 18 века.

Все еще можно найти некоторые деревья Uttwiler Spätlauber, оставшиеся в некоторых областях Швейцарии. Яблоки одного из этих деревьев были использованы для получения эксплантатов ткани, чтобы инициировать культивирование растительных клеток. Успешная жидкостная культура может быть создана в биореакторах стволовых клеток Uttwiler Spätlauber.

Экстракт этих клеток был протестирован в серии исследований на предмет эффективности антивозрастного воздействия на кожу и волосы.

Надписи слева (сверху вниз):

Роговой слой

Гранулярный слой

Шиповатый слой

Базальный слой

Дермис

Надписи справа (сверху вниз):

Эпидермальная стволовая клетка

Временно делящаяся клетка

Базальная мембрана

Надпись под картинкой:

Рисунок 2. Эпидермальная стволовая клетка генерирует временно делящиеся клетки, которые дифференцируются, чтобы образовать стратифицированные слои.

Рисунок 3. Изолированное дерево Uttwiler Spätlauber, обнаруженное в Циммерберге возле Цюрихского озера.

Материалы и методы

Культуры растительных клеток

Яблоки сорта Uttwiler Spätlauber были использованы для отбора подходящего растительного материала. Индукция и субкультивирование каллюса были выполнены согласно стандартным протоколам. Инкорпорация дедифференцированных клеток в подходящей жидкой среде, гомогенизация клеток в суспензии и дальнейшее получение характеристик взвеси отмытых клеток также были выполнены согласно стандартным процедурам.

Для увеличения масштаба 10% следующего большего по объему посева массы полностью развитых отмытых клеток было использовано в качестве инокулята. Формирование биомассы было выполнено в посевах с 50 по 1001 со специальной биореакторной системой (Wave-Biotech AG, Tagelswangen, Швейцария). Культивирование было закончено при температуре 25°C и аэрации 0.1 vvm (vvm – отношение количества подводимого воздуха к ёмкости реактора). Образование биомассы было проконтролировано с помощью анализа общего содержания сахара, проводимости, значения pH и оптической плотности. Производство вторичных метаболитов сопровождалось высокоэффективной жидкостной хромотографией (HPLC) и спектроскопией в ультрафиолетовой и видимой областях спектра (анализом UV/VIS).

Экстракт стволовых клеток Uttwiler Spätlauber был получен после лизиса (растворения) растительных клеток с применением гомогенизации высокого давления. Для подготовки PhytoCellTech™Malus Domestica экстракт был инкорпорирован в лецитиновые липосомы. Состав PhytoCellTech™ Malus Domestica следующий (по МКНИ): культивированные клетки Яблони Садовой, загуститель Е-415, глицерин, лецитин, феноксиэтанол и вода.

Результаты и обсуждение

Защита человеческих стволовых клеток

Стволовые клетки пуповинной крови представляют собой этически корректный источник стволовых клеток человека. Экстракт стволовых клеток Uttwiler Spätlauber был протестирован на клеточную жизнеспособность стволовых клеток пуповинной крови в двух разных исследованиях. Прежде всего, был проанализирован эффект экстракта, оказываемый на пролиферативную активность (разрастание) человеческих стволовых клеток. Был выявлен конкретный, зависимый от концентрации эффект (рис. 4).

Всего при 0.1% концентрации экстракт стимулировал пролиферацию на 80%. Во втором эксперименте стволовые клетки были подвергнуты облучению УФ-лучами. Почти 50% клеток, которые были культивированы только в среде выращивания, умерли, тогда как клетки, культивированные с добавлением экстракта Uttwiler Spätlauber, показали лишь незначительную потерю жизнеспособности (рис. 5).

Реверсия признаков старения в клетках фибробластов

Старение – естественный процесс, который после 50 делений останавливает способность клетки осуществлять дальнейшие деления. Но старение также может случиться в жизни клетки и раньше. Например, как ответ на повреждение клеточного ДНК.

Вертикально:

Номер клетки

Горизонтально:

Контрольная точка 0.01% 0.1%

Надпись внизу:

Рис. 4. Эффект экстракта стволовых клеток Uttwiler Spätlauber на жизнеспособность стволовых клеток пуповинной крови.

Вертикально:

Снижение числа живых клеток в %

Горизонтально:

Контрольная точка 0.01% 0.1%

Надпись внизу:

Рис. 5. Экстракт стволовых клеток Uttwiler Spätlauber защищает стволовые клетки пуповинной крови от УФ-излучения.

Преждевременное старение особенно вредно тогда, когда оно затрагивает стволовые клетки, потому что они необходимы для регенерации ткани. Недавно на основе клеток фибробластов была создана клеточная модель для преждевременного старения. После двух часов обработки H2O2 (периоксидом водорода) клетки показали типичные признаки старения. Эта модель была использована, чтобы доказать эффект антистарения, который оказывает экстракт стволовых клеток Uttwiler Spätlauber.

После обработки H2O2 клетки фибробластов были инкубированы с 2% экстрактом на 144 часа. Затем экспрессия генов была проанализирована с помощью системы кДнк-чипа, включающей 150 замеров, относящихся к клеточному росту, сигнализации, старению и дряхлости. Экспрессия генов была подвергнута сравнению с теми клетками, которые хранились в среде культивирования после обработки H2O2. В контрольном посеве несколько генов, важных для клеточной пролиферации и стимуляции клеточного роста, были подавлены после обработки H2O2 (таблица 1).

Инкубация с экстрактом стволовых клеток Uttwiler Spätlauber нейтрализовала это подавление или даже вызвала рост. Экстракт также сильно простимулировал экспрессию важного антиоксиданта энзима – гемоксигеназа, чья экспрессия неожиданно не повысилась на контроле.

Замедление старения в изолированных волосяных фолликулах

Человеческие волосяные фолликулы могут быть изолированы микродиссекцией от частиц кожи, которые остаются после косметических операций по подтяжке кожи лица. В анагенной фазе собраны только фолликулы.

Волосяные фолликулы – мини-органы, которые представляют естественную кокультивированную модель эпидермальных и меланоцитовых стволовых клеток и дифференцированных клеток. Фолликулы могут быть сохранены в питательной среде, где они растут в длину до 14 дней (примерно).

Потом клетки фолликулов постепенно начинают стареть или подвергаются апоптозу, что является программируемой клеточной смертью. По причине недостаточно циркуляции крови изолированные волосяные фолликулы не могут расти и быть сохраненными в живом состоянии более длительный период. Но изолированные волосяные фолликулы являются тестовыми моделями для выявления активных веществ, которые могут отсрочить процесс некроза. Добавление 0.2% экстракта стволовых клеток Uttwiler Spätlauber способствовало незначительной, но явной «отсрочке» некроза, вызываемого апоптозом и старением.

Рис. 6. показывает, что в экстракте стволовых клеток Uttwiler Spätlauber фолликулы присутствовали, продолжая расти, вплоть до 18 дня, тогда как контрольные фолликулы начали уменьшаться после 14 дня.

Эффект против морщин «гусиные лапки» в области вокруг глаз.

Эффективность PhytoCell-Tec Malus Domestica в борьбе против морщин была продемонстрирована в ходе клинического испытания, которые длилось более 4 недель и затронуло 20 субъектов. Крем с 2% PhytoCellTec™ Malus Domestica наносился на область вокруг глаз дважды в день. Глубина морщин была проанализирована на системе PRIMOS после 2 и 4 недель.

Цифровые фотографии области вокруг глаз были сделаны в начале и в конце исследования. Крем PhytoCellTecTM Malus Domestica обусловил существенное уменьшение глубины морщин после 2 и 4 недель на 8 и 15% соответственно. Эффект может быть хорошо показан с помощью создания 3D-фото. Пример приведен на рисунке 7. Эффект в борьбе с морщинами также может быть показан на цифровых фото (рис. 8).

Ген

Контроль после H2O2 (% по сравнению с необработанными)

Контроль после H2O2 + 2% экстракта (% по сравнению с необработанными)

Циклин B1: вызывает пролиферацию

73

130

Циклин Е1: контролирует клеточный цикл

78

135

Белок P53: супрессор образования злокачественных опухолей

63

137

Инсулиноподобный фактор роста 2: повышает клеточную пролиферацию

71

117

Гемоксигеназа 1: антиоксидант энзим

89

211

Таблица 1. Эффект экстракта стволовых клеток Uttwiler Spätlauber на профиль генной экспрессии клеток фибробластов после обработки H2O2.

Вертикально:

Изменение длины в сравнении с 14 днем (в %)

Синее – контрольный уровень

Зеленое – экстракт стволовых клеток яблока

Горизонтально:

День 16 день 18 день 20

Рисунок 6. Экстракт стволовых клеток Uttwiler Spätlauber повышает продолжительность жизни изолированных человеческих волосяных фолликулов.

Надписи (слева направо):

До (день 0) После (день 28)

Рисунок 7. 3D-снимок с анализом области вокруг глаз до и после нанесения крема с 2% PhytoCellTec™ Malus Domestica.

Надписи (слева направо):

До (день 0) После (день 28)

Рисунок 8. Цифровые фотографии области вокруг глаз до и после лечения кремом с 2% PhytoCellTec™ Malus Domestica.

Выводы

Стволовые клетки – самые важные клетки кожи. Они источник постоянной регенерации эпидермиса, формирования новых волос и волосяных пигментов. Сниженная жизнеспособность и преждевременное старение или апоптоз стволовых клеток – ключевые причины старения ткани. Результаты, представленные в данной статье, показывают, что экстракт стволовых клеток Uttwiler Spätlauber положительно воздействует на жизнеспособность человеческих стволовых клеток, их сопротивляемость старению и апоптозу. Таким образом, экстракт растительных стволовых клеток содействует регенерации кожи и волос и на какое-то время задерживает проявление симптомов стареющей кожи. Конкретный механизм неизвестен, но яблоки Uttwiler Spätlauber, известные своей способностью оставаться свежими невероятно долгое время, имеют, возможно, стволовые клетки с особенным эпигенетическим профилем. Похоже, эти эпигенетические факторы оказывают положительное влияние на стволовые клетки человека.

Список литературы: