Эффекты диметиламиноэтанола и соединений аминокислот на индуцированную D-галактозой стареющую кожу модели подопытной крысы

Научный доклад

Бесконечная мечта человечества – повернуть вспять или остановить процесс старения. В этом исследовании DMAE (Здесь и далее по тексту – ДМАЭ (диметиламиноэтанол). – Прим. Пер) и соединения аминокислот (AA) в мезотерапии были протестированы на предмет их потенциальных омолаживающих эффектов на индуцированную D-галактозой стареющую кожу. На 18 день после введения D-галактозы каждой крысе была сделана внутрикожная микроинъекция раствора хлорида натрия, аминокислот, ДМАЭ 0.1%, ДМАЭ 0.2%, 0.1% ДМАЭ + аминокислоты или 0.2% ДМАЭ + аминокислоты соответственно. На 42 день после начала опытов образцы раневого дефекта кожного покрова были взяты и проанализированы. Показатели толщины эпидермального и дермального слоев в 0.1% ДМАЭ +АА и 0.2% ДМАЭ+АА группах были значительно выше, чем у крыс контрольного возраста.

Различий в содержании воды в ткани между группами не было найдено. Содержание гидроксипролина в 0.1% ДМАЭ +АА, 0.2% ДМАЭ + АА и контрольных симуляционных группах было намного выше, чем во всех остальных группах. Содержание коллагенов 1 и 3 типов и экспрессия матриксной металлопротеиназы-1 (ММП-1) значительно повысились в обеих группах (0.1% ДМАЭ + АА и 0.2% ДМАЭ + АА) по сравнению с группой контрольного возраста. Для сравнения, уровни экспрессии тканевого ингибитора матричной металлопротеиназы (ТИМП-1) у различных возрастных групп были значительно понижены в сравнении с контрольной симуляционной группой. Одновременная инъекция ДМАЭ и АА в целевые ткани показала омолаживающие эффекты на индуцированную D-галактозой стареющую кожу подопытной крысы.

Введение

Омоложение – вечная мечта человечества. Связанные с возрастом изменения кожи неизбежны и включают снижение толщины и обвисание кожи, морщины, потерю эластичности, сухость и нарушенное соотношение коллагенов 1 и 3 и типов в коже, что выражается в пониженном синтезе коллагена 1 типа, и повышенном – 3 типа. На сегодняшний день мезотерапия вызывает всеобщий интерес как омолаживающая методика. Это минимально инвазивная процедура, которая состоит из внутрикожных микроинъекций фармакологических субстанций, таких как питательные элементы, гормоны, витамины, ферменты и другие реагенты, которые были очищены и введены непосредственно в ту область, которая нуждается в лечении.

При профессиональной практике в стерильных условиях мезотерапия очень редко вызывает кожные инфекции или некроз: остаются лишь некоторые минимальные риски возникновения отеков и болезненных ощущений при инъекции. Будучи безопасной, простой и менее болезненной процедурой (одной из так называемых «косметических процедур на скорую руку»), она не требует времени на восстановление и идеально подходит для профессионалов и успешных людей в быстро меняющейся современной жизни.

ДМАЭ, аналог витамина B (холина) и прекурсор ацетилхолина, сегодня становится все более популярной добавкой в продуктах по уходу за кожей благодаря его ярко выраженным омолаживающим, противоморщинным и подтягивающим эффектам. ДМАЭ популярен в контексте наружного применения. В рандомизированных клинических исследованиях 3% ДМАЭ-гель для лица показал себя безопасным и эффективным средством смягчения морщин на лбу и уменьшения мелких периорбитальных морщин, а также улучшения полноты и формы губ и общего вида кожи лица.

Продленная фаза открытого клинического исследования также показала, что длительное применение ДМАЭ-геля (вплоть до 1 года) отражает хороший профиль безопасности препарата. Впрочем, при наружном применении ДМАЭ необходимы высокая концентрация и большая доза, чтобы пройти через эпидермальный пленочный барьер, что может вызвать вопросы о его токсичности, побочных эффектах и медицинских затратах. Было заявлено, что 2.5-10 ммол/мл ДМАЭ может вызвать вакуолярную цитопатологию в лабораторно культивированных клетках фибробластов человека.

В дополнение исследование показало, что наружное нанесение 3% ДМАЭ-геля также может вызвать вакуолярную цитопатологию эпидермальных клеток кроличьего уха. Альтернативная доставка ДМАЭ необходима для оценки относительной эффективности улучшений стареющей кожи.

Чтобы оценить потенциальный омолаживающий эффект низких доз ДМАЭ, введенных внутренне с помощью микроинъекций (мезотерапии), в этом исследовании были измерены структура ткани и метаболизм коллагена индуцированной D-галактозой стареющей кожи. В то же время одновременная инъекция сложных аминокислот, ведущая к уменьшению клеточной токсичности от инъекции ДМАЭ и являющаяся поставщиком питательных веществ, также была изучена. Был описан их предполагаемый механизм воздействия на кожу.

Материалы и методы

Животные


Мужские особи крыс Вистар были закуплены в институте фармакологических наук (Qingdao, Китай). На момент операции вес всех животных составлял 180-200 г. Условия содержания животных и описание опытов были одобрены Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School Institutional Animal Care and Use Committee.

Всего 80 крыс Вистар были случайным образом разделены на опытные группы (как описано в Таблице 1). Животным из каждой опытной группы, за исключением симуляционной контрольной группы, вводились подкожные инъекции с D-галактозой в дозировке 125 мг/кг-сутки на протяжении 6 недель для создания модели кожи стареющей кожи. После 18 дней инъекций D-галактозы каждая крыса была анестезирована хлоралгидратом (0.25 мл на 100 г. веса) и дезинфицирована в области бедра.

3 см. круглая контрольная зона была подготовлена на каждом бедре крысы и затем под общей анестезией обработана раз в неделю в течении 4 недель внутрикожными микроинъекциями соляного раствора, АА, 0.1% ДМАЭ, 0.2% ДМАЭ, 0.1% ДМАЭ + АА или 0.2% ДМАЭ + АА соответственно. Обе группы – и симуляционная, и группа плацебо, – подверглись такому же хирургическому вмешательству без лечения во время исследований. Через 42 дня после начала обработки все животные были умерщвлены, и образцы раневых дефектов кожного покрова были сравнены при помощи гистологического анализа, замеров содержания воды и гидроксипролина, а также количественного ПЦР-тестирования в реальном времени.

Таблица 1.

Схема эксперимента (NS: 0.9% хлорид натрия; АА: 3.48% сложных аминокислот; ДМАЭ: диметиламиноэтанол)

Group number

Pretreatment 
(D-galactose, 6 weeks)

Microinjection 
(once a week, 4 weeks)

Size (n)

Aging groups

1

125 mg/kg·d

Negative control

10

2

125 mg/kg·d

NS

10

3

125 mg/kg·d

AA

10

4

125 mg/kg·d

0.1% DMAE

10

5

125 mg/kg·d

0.2% DMAE

10

6

125 mg/kg·d

0.1% DMAE + AA

10

7

125 mg/kg·d

0.2% DMAE + AA

10


Sham control

8

10

Горизонтальные обозначения (слева направо):

Номер группы

Предварительное лечение (D-галактоза, 6 недель)

Микроинъекция (один раз в неделю, 4 недели)

Size (n)

Размер выборки

Вертикальные:

Состаренные группы

Симуляционная группа

Внутри таблицы:

125 мг/кг-сутки

Плацебо

Гистопатология

Толщина кожи была замерена с помощью анализирующей программы SimplePCI Image (Hamamatsu Corporation, Boston, MA) в секциях, помеченных гематокслином и эозином. Толщина эпидермиса была измерена от поверхности рогового слоя до основания кожных сосочков, в то время как толщина дермального слоя была замерена от верха сосочков до самой глубокой точки сетчатого слоя кожи (пока не была достигнута мышца или жировая ткань). При одинаковом увеличении пять индивидуальных позиций были случайным образом выбраны для измерения толщины кожи в 5 разных ракурсах в каждой секции. Во всех секциях, где трихромы были окрашены по Массону, 5 ракурсов были случайным образом выбраны и проанализированы на предмет плотности коллагенового волокна.

2.3 Измерение содержания воды

1 кв. см. раневого дефекта кожного покрова был извлечен для точного измерения реального веса, после чего образец был запечен при температуре 80 °C для измерения «сухого» веса. Содержание влаги в коже было подсчитано при помощи формулы процентного содержания воды = ((реальный вес – сухой вес) /реальный вес) *Х 100%.

Измерение содержания гидроксипролина.

Содержание гидроксипролина в раневом дефекте кожного покрова было измерено согласно протоколу производителя коммерческих наборов реактивов (NANJING JIANCHEN biological engineering Co., LTD, Nanjing, China).

2.5 Количественная ПЦР с детекцией в реальном времени (qRT-PCR)

Раневые дефекты кожных покровов были гомогенизированы в TRIzol1 (Invitrogen), и общая РНК была извлечена в соответствии с протоколом производителя. 1 мг общей РНК был обратно считан в кДНК при использовании PrimeScript RT Synthesis System (Takara Biotechnology/Takara Bio, Dalian, China). Высокочувствительный количественный ПЦР-метод был осуществлен с кДнк продуктами. Индивидуальные праймеры и образцы были оценены на предмет их эффективности (как показано в Таблице 2). 10 мл реактивной смеси содержало двойной Power SYBR1 Green PCR Master Mix, десятикратно разведенную кДнк  и 0.2 мМ каждого праймера. Термальный протокол состоял из 10 мин полимеразной активации при 95 °C, затем из 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 30 секунд, и следом – ренатурации праймеров при 55 °C в течение 1 мин. и их достройки при 72 °C в течение 30 сек. Уровни экспрессии мРНК были нормализованы до уровня B-действия эндогенного референсного гена и представлены как кратные измерения тех, которые были получены из образцов кожи контрольной возрастной группы.

Таблица 2

Пары праймеров для целевых и конститутивных генов для количественного ПЦР анализа.

Target gene 
accession number

Sequences

Probe length

Forward

Reverse

Col α1 I 
NM_053304.1

ATGTCTGGTTTGGA 
GAGAGCA 

GAGGAGCAGGGAC 
TTCTTGAG 

203 bp 

Col α1 III 
NM_032085.1

GCCTCCCAGAACAT 
TACATACC 

TTTGCTATTTCCTTC 
AGCCTTG 

132 bp 

MMP-1α  
NM_001134530.1

CTCCCTTGGACTCA 
CTCATTCTA 

AGAACATCACCTCT 
CCCCTAAAC 

227 bp 

TIMP-1 
NM_053819.1

TGGCATCCTCTTGTT 
GCTATC 

CGAATCCTTTGAGC 
ATCTTAGTC 

191 bp 

β-Action 
NM_031144.3

GGAGATTACTGCCC 
TGGCTCCTA

GACTCATCGTACTC 
CTGCTTGCTG

150 bp

Горизонтальные обозначения (слева направо):

Учетный номер целевого гена

Forward

Прямая

Последовательность

Reverse

Обратная    

Длина образца

Статистический анализ

Данные были выражены с учетом стандартных отклонений. Статистический анализ был проведен дисперсионным анализом ANOVA с использованием программного обеспечения SPSS17.0. Результаты являются статистически достоверными с уровнем вероятности p < 0.05.

Результаты

3.1 Гистологические изменения

Стареющая кожа продемонстрировала снижение толщины эпидермиса и дермиса в сравнении с крысами симуляционной группы. С возрастом содержание эпидермиса в кожных слоях снижается, а дермальные коллагеновые волокна становятся редкими, тонкими или разрушенными. Но в сравнении с контрольной группой старения эти гистологические изменения значительно улучшились в 0.1% ДМАЭ +АА, 0.2% ДМАЭ + АА и 0.2% ДМАЭ группах (Рисунки 1(а) – 1(h))

Рисунок 1

Гистологический вид раневого дефекта кожного покрова из подопытных стареющих крыс, индуцированных D-галактозой. На 42 день после каждой обработки для гистологии были собраны образцы раневых дефектов кожного покрова. Показательные изображения секций, окрашенных ГЭ, были представлены при слабом увеличении (40х, масштабная линейка = 50 мкм). Буквы а - h относятся к состаренной контрольной, состаренной NS, состаренной АА, состаренной 0.1% ДМАЭ, состаренной 0.2% ДМАЭ, состаренной 0.1% ДМАЭ + АА, состаренной 0.2% ДМАЭ + АА и симуляционной группам соответственно.

При обработке 0.1% ДМАЭ + АА или 0.2% ДМАЭ + АА и эпидермальная, и дермальная толщина и плотность коллагеновых волокон были значительно повышены в сравнении с состаренной контрольной группой. В отдельной группе 0.2% ДМАЭ также значительно повысились показатели толщины эпидермиса и плотности коллагеновых волокон в сравнении с состаренной контрольной группой. Тем не менее, эти три параметра у всех состаренных групп были значительно понижены по сравнению с теми же параметрами симуляционной группы (Рисунки 2(а), 2(b) и 2(c)).

An external file that holds a picture, illustration, etc.
Object name is TSWJ2014-507351.002.jpg

  

Вертикальные надписи в таблицах:

а) толщина эпидермиса (мкм),

b) толщина дермиса (мкм),

c) плотность коллагенового волокна (мм2),

d) содержание воды (%),

e) содержание гидроксипролина (мкг/мг протеин).

Рисунок 2

Физические характеристики индуцированной D-галактозой раны состаренной кожи после каждой обработки. (а) эпидермальная толщина (мкм), (b) дермальная толщина (мкм), (с) плотность коллагеновых волокон (мм2), (d) содержание воды (%), (е) содержание гидроксипролина (мкг/мг протеин). ∗, †, $, Ψ, Σ, and ® показали значительное изменение (p < 0.05) относительно группы плацебо, симуляционной группы, NS, AA, 0.1% ДМАЭ и 0.2% ДМАЭ соответственно. Что касается анализа содержания воды, не было отмечено значительной разницы между всеми исследуемыми группами.

3.2 Содержание воды в стареющей коже

Не было статистически значимых различий в содержании воды во всех группах (Рисунок 2(d)).

3.3 Содержание гидроксипролина в стареющей коже.

Содержание гидроксипролина было значительно увеличено в стареющей коже, обработанной как 0.1% ДМАЭ +АА, так и 0.2% ДМАЭ + комплексом АА, что показало значительные различия по сравнению со всеми остальными состаренными группами. Интересно, что содержание гидроксипролина в группе 0.2% ДМАЭ + АА достигло того же уровня, что и в симуляционной группе, но было значительно выше, чем у остальных 6 состаренных групп. Не было значительных изменений между группами 0.1% ДМАЭ +АА и 0.2% ДМАЭ +АА (Рисунок 2(е)).

3.4 Уровень экспрессии мРНК типа 1, проколлагена типа 3, матриксной металлопротеиназы-1 (ММП-1) и целевых генов тканевого ингибитора матричной металлопротеиназы-1 (ТИМП-1).

Уровень экспрессии коллагена 1 типа был сильно повышен при обработке растворами 0.1% ДМАЭ +АА и 0.2% ДМАЭ + АА, что не показало значительных отличий по сравнению с симуляционной группой. При этом каждая из оставшихся состаренных групп показала намного более заниженный уровень экспрессии коллагена 1 типа в сравнении с симуляционной группой крыс (рисунок 3(а)). При обработке 0.1% ДМАЭ +АА, 0.2% ДМАЭ + АА или одним лишь 0.2% ДМАЭ, транскриптные уровни коллагена 3 типа были значительно завышены у контрольной состаренной группы, но значительно понижены в сравнении с симуляционной группой (рисунок 3(b)). Реакции матриксной металлопротеиназы, как потенциального ключевого регулятора старения кожи, увеличились после обработки 0.1% ДМАЭ + АА или 0.2% ДМАЭ + АА, что показало значительное статистическое различие по сравнению с контрольной группой старения, но не с симуляционной группой крыс (рисунок 3(с)). В отличие от вышеописанного, транскриптные уровни тканевого ингибитора матричной металлопротеиназы-1 у всех состаренных групп были значительно понижены на более низкий уровень, чем у симуляционной группы (рисунок 3(d)).

Измерение метаболизма коллагена в стареющей, индуцированной D-галактозой коже после каждой обработки. Образцы раневого дефекта кожного покрова были обработаны и исследованы на экспрессию коллагенов типа 1 (а), 3 (b), ММП-1 (c) и ее ингибитора и ТИМП-1 (d) при помощи количественного ПЦР-тестирования. Уровни экспрессии каждого целевого гена были нормализованы до уровня эндогенного референсного гена и указаны в относительных величинах (ΔΔCt) в сравнении со взятыми у контрольной состаренной группы. ∗ и † показывают значительную разницу (P < 0.05) при сравнении с группой плацебо (группой 1) и симуляционной группой (группой 8) соответственно.

4. Обсуждение.

Инъекция низких доз D-галактозы в кожу крыс может вызвать изменения, которые похожи на ускоренное старение. В наших исследованиях модель стареющей крысы показала изменение цвета волос, пониженную активность и неврологические патологии. Гистологические изменения индуцированной D-галактозой стареющей кожи представлены в виде более тонкого эпидермиса со сниженными уровнями клеточных слоев, и редкими, тонкими или разрушенными коллагеновыми волокнами в дермальном слое. Более того, эта состаренная кожа показала заниженные уровни содержания гидроксипролина и реакций мРНК для 1 и 3 типов коллагена, ММП-1, ТИМП-1 в сравнении с тканью нормальной кожи. Учитывая эти данные, предполагается, что инъекции 125 мг/кг-сутки D-галактозы на протяжении 6 недель технически целесообразны для создания подострой стареющей модели для мимикрирования стареющей человеческой кожи.

Наши исследования показали, что одновременные инъекции ДМАЭ и АА повысили уровни содержания гидроксипролина и экспрессию коллагена 1 типа в индуцированной D-галактозой стареющей коже, что почти достигло того же уровня, что и в ткани нормальной кожи после вкалывания высоких доз 0.2% ДМАЭ +АА. Гистологические изменения проявились в увеличении толщины эпидермального и дермального слоев и в высокой плотности дермальных коллагеновых волокон. Более интересно то, что мезотерапия при помощи одновременных инъекций ДМАЭ и АА значительно повысила экспрессию ММП-1 гена в стареющей коже на уровень, соответствующий нормальным крысам, но не на уровень ингибитора ТИМП-1, который был значительно понижен у всех стареющих крыс.

Исходя из данных результатов, предполагается, что мезотерапия путем одновременного введения ДМАЭ и АА оказала положительное влияние на регуляцию катаболизма коллагенов при лечении и восстановлении стареющей кожи и замедлении процесса старения кожи. Предыдущие исследования показали заниженную выработку коллагена 1 типа и повышенный синтез коллагена 3 типа и ММП-1 стареющей кожи. Но наши результаты показали, что экспрессия мРНК коллагена 3 типа и ММП-1 была значительно меньше у контрольной состаренной группы в сравнении с нормальным крысами. Это может означать, что метаболизм коллагена при изменении нормальной кожи в процессе старения и у подострой модели индуцированной D-галактозой кожи проходит по-разному.

Наши исследования также показали, что инъекции ДМАЭ или только АА не произвели никакого эффекта на содержание гидроксипролина или реакции коллагена 1 типа и ММП-1 в стареющей коже. Эти данные показывают, что параллельное использование ДМАЭ и АА может быть единственным способом раскрытия их омолаживающего действия в этой индуцированной D-галактозой модели стареющей кожи при помощи модуляции метаболизма коллагена 1 типа и повторного формирования структуры стареющей кожи.

Предыдущие исследования показали, что культивированные дермальные фибробласты кролика среагировали на ДМАЭ массивной вакуолизацией зависимым от концентрации способом. Эпидермис внешнего уха кролика также стал более толстым и показал чистый перинуклеарный отек, что говорит о вакуолизации в ответ на внешнее нанесение 3% ДМАЭ. Это предполагает, что вакуолярная цитопатология может быть неотделима от улучшения вида кожи, которые быстро проявляются после наружного нанесения ДМАЭ, и может быть цитологической основой противоморщинного эффекта ДМАЭ.

Исходя из наших результатов, вакуолизация дермального фибробласта может произойти в стареющей коже, обработанной и 0.1%, и 0.2% ДМАЭ, и проявиться в виде цитологического отека и повышенной плотности коллагеновых волокон. Эпительные клетки стареющей кожи также могут реагировать на высокую концентрацию 0.2% ДМАЭ вакуолизацией, которая проявляется в виде утолщения эпидермиса. Как бы там ни было, для разъяснения этого вопроса могут потребоваться дальнейшие исследования.

В дополнение: измерение содержания воды в коже показало отсутствие разницы между всеми крысами, что предполагает, что ДМАЭ и сложные АА оказывают ограниченный эффект на увлажнение кожи. Это может быть вызвано низким уровнем концентрации и коротким периодом локального воздействия ДМАЭ в эпидермальном слое при прямой доставке ДМАЭ с помощью подкожных инъекций, что отличается от наружного нанесения ДМАЭ.

Выводы

У индуцированной D-галактозой модели стареющей крысы мезотерапия, при помощи прямой доставки ДМАЭ и АА в целевую ткань, проявила омолаживающие эффекты благодаря ускорению синтеза и катаболизма коллагена для реформирования структуры кожи и улучшения толщины стареющей кожи. Несмотря на то, что в этих экспериментах была использована модель крысы, результаты имеют значение для клинических исследований. Дальнейшие исследования, направленные на понимание механизма действия ДМАЭ и сложных аминокислот в стареющей коже, помогут при разработке и тестировании более сильных и эффективных продуктов по уходу за кожей для последующей оценки влияния на человека.

Конфликт интересов.

Авторы заявляют, что не существует никакого конфликта интересов, касающегося публикации данного доклада.

Источник